另辟蹊徑尋找抗生素

Robert Heinzen第一次試圖讓貝氏柯克斯體菌自己生長卻慘遭失敗。這種會(huì)引發(fā)被稱為Q熱的類似流感狀疾病的細(xì)菌，通常只在其感染的細(xì)胞中分裂。這迫使研究人員不得不在哺乳動(dòng)物的組織中使其生長出來，并且阻礙了他們研究這種微生物的努力。當(dāng)上世紀(jì)90年代初Heinzen在博士后期間試圖找到一種不同的方式培養(yǎng)這種細(xì)菌時(shí)，他得到的只是半本潦草的筆記。

不過，這個(gè)問題讓他終日不得安寧。直到2003年，貝氏柯克斯體的基因組被測序出來，同時(shí)Heinzen在蒙大拿州哈密爾頓市的美國國立衛(wèi)生研究院落基山實(shí)驗(yàn)室創(chuàng)建了自己的實(shí)驗(yàn)室。他認(rèn)為，基因組能提供關(guān)于這種細(xì)菌新陳代謝和生長的重要線索。即便如此，Heinzen指導(dǎo)的博士后Anders Omsland還是花費(fèi)了近4年的時(shí)間系統(tǒng)測試過上百種不同組合的培養(yǎng)條件，才找到在細(xì)胞外培養(yǎng)這種細(xì)菌的完美“食譜”。“當(dāng)他把培養(yǎng)菌拿給我看時(shí)，我本以為那是一種污染物?！盚einzen回憶說。然而，隨后幾個(gè)月的努力證實(shí)了他們的成功。

貝氏柯克斯體依然屬于少數(shù)。據(jù)估計(jì)，有85%～99%的細(xì)菌和古生菌尚無法在實(shí)驗(yàn)室中被生長出來。這極大地限制了科學(xué)家對微生物生命的了解，并且阻礙了對通常來自細(xì)菌的新抗生素的尋找。隨著現(xiàn)有藥物的耐藥性急劇上升，這種研究正變得更加迫切：上個(gè)月，世界衛(wèi)生組織批準(zhǔn)一項(xiàng)阻擊抗生素抗藥性的全球計(jì)劃，同時(shí)一個(gè)由英國政府指派的評審小組呼吁全球制藥行業(yè)投入13億英鎊（合20億美元）復(fù)興抗生素研究。為尋找新藥，研究人員表示，他們需要一些替代方法，以調(diào)查一系列未被培養(yǎng)出來的生物體——微生物世界中的神秘“暗物質(zhì)”。

雞尾酒培養(yǎng)法

按照慣例，生物學(xué)家通過在一系列相當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)的營養(yǎng)物質(zhì)中生長出某一物種的純培養(yǎng)物來研究微生物。然而，麻煩在于細(xì)菌并不像在自然界中那樣生活：它們居住在一個(gè)非常寬廣的環(huán)境范圍內(nèi)，并且通常伴有其他有機(jī)體，而科學(xué)家一直在試圖重新創(chuàng)造這些條件。不過，正如Heinzen和Omsland在他們關(guān)于貝氏柯克斯體的研究中所展示的，基因序列能打開一扇門。

Omsland利用測序?qū)⒓?xì)菌在宿主細(xì)胞內(nèi)成功生長時(shí)所表達(dá)的基因同它們試圖獨(dú)自生長時(shí)所表達(dá)的基因進(jìn)行比較。他發(fā)現(xiàn)，一套涉及蛋白質(zhì)合成的基因在苦苦掙扎的細(xì)菌內(nèi)較不活躍。這暗示，向培養(yǎng)基中加入氨基酸和縮氨酸或許有助于細(xì)菌變得繁盛。不過，即使在Omsland成功地將細(xì)菌的蛋白質(zhì)合成增加13倍時(shí)，它仍然無法分裂。

最終的線索來自證明貝氏柯克斯體能在低氧環(huán)境中生存下來的基因。當(dāng)研究團(tuán)隊(duì)將這種細(xì)菌放置在5%或者更少的氧氣中時(shí)，他們最終看到它在生長?！斑@是至關(guān)重要的發(fā)現(xiàn)。”Heinzen表示，它不是營養(yǎng)物質(zhì)，而是環(huán)境因素。

自從采用無異種生物混雜或沒有宿主的新培養(yǎng)技術(shù)，貝氏柯克斯體研究領(lǐng)域得到極大的擴(kuò)展。通過選擇性地打開或關(guān)閉基因，研究人員了解了這種細(xì)菌是如何同宿主細(xì)胞發(fā)生相互作用，進(jìn)而將后者感染并且發(fā)生分裂的?！昂敛豢鋸埖卣f，在無異種生物混雜的情況下生長貝氏柯克斯體已經(jīng)徹底改變了這個(gè)研究領(lǐng)域?！卑拇罄麃喣珷柋敬髮W(xué)微生物學(xué)家、貝氏柯克斯體研究者Hayley Newton表示。這種細(xì)菌在空氣中具有高度傳染性，并且被認(rèn)為是一個(gè)可能的生物威脅。目前，Heinzen的實(shí)驗(yàn)室正致力于制造致病基因已被滅活的菌株，以期它們在研發(fā)疫苗時(shí)能派上用場。

同時(shí)，研究人員正在設(shè)計(jì)針對只在細(xì)胞內(nèi)生長的其他微生物的培養(yǎng)體系。已在華盛頓州立大學(xué)就職的Omsland開發(fā)出一種針對導(dǎo)致最常見性傳播疾病的病菌——沙眼衣原體的無細(xì)胞培養(yǎng)體系。他說，目前尚未誘導(dǎo)沙眼衣原體在培養(yǎng)基中分裂，但“我生性樂觀”，在貝氏柯克斯體上取得成功為他的希望提供了“燃料”。

微型化的培養(yǎng)物

加速尋找培養(yǎng)“食譜”過程的一種方法是利用微流體芯片。這是一種擁有被不同通道連接起來、使其有可能同時(shí)運(yùn)行很多試驗(yàn)的上千個(gè)微小凹槽。在利用此方法培養(yǎng)出一種新的細(xì)菌后，來自加州理工學(xué)院的Rustem Ismagilov和他的合作者甚至將其命名為isolate microfluidicus 1。

當(dāng)2012年一群微生物學(xué)家發(fā)表了一個(gè)“最想要的”分類群清單時(shí)，Ismagilov已經(jīng)在研究微流體。當(dāng)時(shí)，他們呼吁科研界生長并且測序在人體內(nèi)相對常見、同已測序生物體關(guān)聯(lián)較遠(yuǎn)并且躲避所有培養(yǎng)嘗試的微生物。

Ismagilov和他的團(tuán)隊(duì)用一種容納3200個(gè)納升大小的凹槽并且能放在手掌中的設(shè)備回應(yīng)了這種呼吁。他們從一名健康志愿者的腸壁上刮取了樣品，然后將其稀釋，以至于每個(gè)凹槽中僅有一個(gè)細(xì)胞。通過填滿如此多的凹槽，研究人員增加了他們的目標(biāo)微生物—— 一種顫桿菌克屬人體腸道細(xì)菌找到進(jìn)入至少一些凹槽的道路的機(jī)會(huì)。該團(tuán)隊(duì)利用約10個(gè)芯片測試各種條件，并且尋找這種細(xì)菌的生長。

他們成功地找到了細(xì)菌，然后在皮氏培養(yǎng)皿中生長出更多的細(xì)菌。這是最想要清單上最早被培養(yǎng)出來的成員之一。進(jìn)一步的遺傳學(xué)研究顯示，isolate microfluidicus 1被錯(cuò)誤地分類，實(shí)際上并不是顫桿菌克屬。其實(shí)，它是一個(gè)新的相關(guān)菌群的一部分。目前，該團(tuán)隊(duì)正在描繪新菌群的特征。

該團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，生長這種細(xì)菌的一個(gè)重要成分是從志愿者腸道內(nèi)提取出的少量液體。Ismagilov介紹說，能在上千種試驗(yàn)中擴(kuò)展這個(gè)珍貴樣品的使用是微流體方法的一個(gè)重要優(yōu)勢。另一個(gè)優(yōu)勢在于每個(gè)初始細(xì)胞無須同其他種群競爭。

密歇根大學(xué)化學(xué)工程師Xiaoxia Nina Lin正利用微流體在人體糞便樣品中“追捕”最想要清單上的成員。細(xì)菌通常生活在復(fù)雜的群落中，并且經(jīng)常依賴于其他種群。為此，Lin正嘗試將兩個(gè)、三個(gè)或四個(gè)細(xì)胞的無數(shù)種組合放在一起并且放置在芯片上，以剖析這些關(guān)系，并且找到誰依賴誰?！斑@是一種很好的工程學(xué)方法?！闭趲椭鶯in獲取臨床樣品的密歇根大學(xué)傳染性疾病研究人員Vincent Young說，你能快速減少復(fù)雜度。

不要培養(yǎng)要測序

盡管取得了這些成功，培養(yǎng)細(xì)菌仍是一項(xiàng)復(fù)雜且需要碰運(yùn)氣的事情。因此，很多研究人員正在完全繞開它，相反從基因中獲取信息。測序手段的進(jìn)步意味著現(xiàn)在科學(xué)家能分析未被培養(yǎng)出來的單個(gè)微生物細(xì)胞的基因組，而不是像此前那樣，測序由很多不同類型微生物構(gòu)成的群落，然后努力將這些序列重新拼湊回去。

來自美國能源部聯(lián)合基因組研究院的Tanja Woyke首次對單細(xì)胞測序產(chǎn)生興趣是在十年前一個(gè)關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生的不久之后。這個(gè)發(fā)現(xiàn)是一種來自被細(xì)菌感染病毒的酶能被用于制作一種細(xì)菌細(xì)胞基因組的很多個(gè)副本。Woyke想利用測序工具填寫生命的微生物樹。

她和團(tuán)隊(duì)成員采集了來自9個(gè)不同生境的樣品，包括來自內(nèi)華達(dá)州一處溫泉的沉積物和太平洋深海熱液噴口的水。他們分離出約200個(gè)細(xì)胞，對每個(gè)基因組進(jìn)行測序，并且把細(xì)胞分成20多個(gè)不含有任何被培養(yǎng)出來的代表細(xì)菌的新世系?！皬谋环治龅男蛄泻蛦渭?xì)胞數(shù)量這個(gè)角度來說，他們首次真正將單細(xì)胞基因組學(xué)提高到一個(gè)新水平。”德國維爾茨堡大學(xué)海洋微生物學(xué)家Ute Hentschel說。

去年，來自瑞士聯(lián)邦理工學(xué)院的J?觟rn Piel和他的同事報(bào)告稱，他們利用單細(xì)胞測序和其他技術(shù)在海綿中確認(rèn)了未被培養(yǎng)出來的細(xì)菌。這些濾食性生物一直是科學(xué)家的興趣所在，因?yàn)樗鼈儺a(chǎn)生一系列具有抗癌、抗菌和其他藥物價(jià)值的豐富化學(xué)物質(zhì)。它們還庇護(hù)著占據(jù)40%海綿質(zhì)量的密集微生物群落，并且被推測是這些化學(xué)物質(zhì)的來源。不過，這些群落的成員一直未被培養(yǎng)出來。

Piel和他的團(tuán)隊(duì)將關(guān)注點(diǎn)放在Theonella swinhoei海綿上。其庇護(hù)著約1000種細(xì)菌，并且產(chǎn)生幾十種具有生物活性的已知化合物。2011年，他們開始對從海綿樣品中分離出來的單個(gè)細(xì)菌細(xì)胞的DNA進(jìn)行測序，并且找到兩個(gè)已知涉及具有生物活性的分子生產(chǎn)的基因簇。他們在一種名為Entotheonella的細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了這些基因。

不過，最令Piel驚奇的是，這種生物體對同海綿相關(guān)的幾乎所有具有生物活性的化合物負(fù)責(zé)。當(dāng)序列數(shù)據(jù)顯示這種細(xì)菌庇護(hù)著所有必要基因時(shí)，這一點(diǎn)變得清晰起來。在Piel從他的合作者那兒接收到關(guān)鍵數(shù)據(jù)時(shí)，“我?guī)缀鯊囊巫由系聛怼薄＿@是一種未被培養(yǎng)出來的細(xì)菌能成為具有生物活性的化學(xué)物質(zhì)的如此“天才”生產(chǎn)者的首個(gè)證據(jù)?！霸趩我痪曛袆?chuàng)造很多不同化合物的能力并不常見?！盤iel說。

目前，Piel的實(shí)驗(yàn)室正試圖將來自Entotheonella的基因簇改造成一種可以培養(yǎng)的生物體比如大腸桿菌，從而使宿主能大量生產(chǎn)化合物。他還在挖掘來自日本、巴布亞新幾內(nèi)亞和以色列的海綿細(xì)菌基因組，以期尋找其他細(xì)菌超級(jí)生產(chǎn)者。

《中國科學(xué)報(bào)》 (2015-06-25 第3版 國際)